Scisne?

Жизнь начиналась с РНК

Валентин Власов, Александр Власов

Комментарии: 0

Прежде чем отправиться к «началу начал», давайте запасёмся необходимыми знаниями о строении нуклеиновых кислот — ДНК (дезоксирибонуклеиновой) и РНК (рибонуклеиновой). По своему химическому составу РНК является двойняшкой, хотя и не полным близнецом, ДНК, основного хранителя генетической информации в живой клетке. Нуклеиновые кислоты представляют собой полимерные макромолекулы, состоящие из отдельных звеньев — нуклеотидов. Скелетом макромолекулы являются молекулы пятиуглеродного сахара, соединённые остатками фосфорной кислоты. К каждой молекуле сахара присоединяется одно азотистое основание. Нуклеотиды, которые различаются между собою только разными азотистыми основаниями, обозначаются буквами A, U, G, C (в РНК) и A, T, G, C (в ДНК).

Знаменитая двойная спираль ДНК представляет собой жёсткую структуру. Две цепи ДНК удерживаются вместе за счет образования множества слабых водородных связей между парами нуклеотидов. Такие подходящие друг к другу молекулы, способные к взаимодействию, называют комплементарными.
Знаменитая двойная спираль ДНК представляет собой жёсткую структуру. Две цепи ДНК удерживаются вместе за счёт образования множества слабых водородных связей между парами нуклеотидов. Такие подходящие друг к другу молекулы, способные к взаимодействию, называют комплементарными.

Главное отличие нуклеиновых кислот заключается в их углеводной компоненте. В РНК сахар — рибоза, а в ДНК — дезоксирибоза: там, где у ДНК имеется атом водорода (H), у РНК стоит оксигруппа (OH). Результаты таких незначительных, на неискушённый взгляд, различий поражают. Так, ДНК существуют в основном в форме всем известных жёстких спиралей, в которых две цепи ДНК удерживаются вместе за счёт образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами.

Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК — устроены по одному принципу. Это сложные полимерные молекулы, состоящие из множества звеньев, каждое из которых включает в себя сахар, фосфорную кислоту и азотистое основание.
Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК — устроены по одному принципу. Это сложные полимерные молекулы, состоящие из множества звеньев, каждое из которых включает в себя сахар, фосфорную кислоту и азотистое основание. Однако различия между ними существуют. В сахаре РНК (рибозе) присутствует OH-группа, в отличие от сахара ДНК (дезоксирибозы). Кроме того, ДНК и РНК отличаются по одному из четырёх азотистых оснований: тимин (T) в ДНК отличается от урацила (U) в РНК наличием метильной группы.

РНК также могут формировать спирали из двух цепочек, похожие на спирали ДНК, однако в большинстве случаев РНК существуют в виде сложных структур-клубков. Структуры эти формируются не только за счёт образования упомянутых водородных связей между разными участками РНК, но и благодаря оксигруппе рибозы, которая может образовывать дополнительные водородные связи и взаимодействовать с фосфорной кислотой и ионами металлов. Глобулярные структуры РНК не только внешне напоминают белковые структуры, но и приближаются к ним по свойствам: они могут взаимодействовать с самыми разными молекулами, как маленькими, так и полимерными.

Кого считать «живым»?

Почему же именно РНК мы называем праматерью ныне существующей жизни? Чтобы ответить на этот вопрос, давайте разберёмся, где проходит граница между живым и неживым.

Поскольку над проблемой происхождения жизни работают учёные из разных областей, каждый оперирует терминами близкой ему науки. Химики обязательно вспомнят слово «катализатор», математики — «информация». Биологи будут считать живой систему, содержащую вещество (генетическую программу), которое может копироваться (или, по-простому, размножаться). При этом необходимо, чтобы в ходе такого копирования могли происходить некоторые изменения наследственной информации и возникать новые варианты систем, т. е., должна существовать возможность эволюции. Ещё биологи обязательно заметят, что такие системы должны быть пространственно обособленны. Иначе возникшие более прогрессивные системы не смогут воспользоваться своими преимуществами, поскольку их более эффективные катализаторы и другие продукты будут беспрепятственно «уплывать» в окружающую среду.

Каким же образом первые молекулярные системы были обособлены от окружающей среды? Колонии молекул могли, например, удерживаться вместе за счёт адсорбции на какой-нибудь минеральной поверхности или пылевых частицах. Однако возможно, что уже самые примитивные системы располагали, подобно современным живым клеткам, настоящей мембранной оболочкой. Дело в том, что такая «протоклетка» с липидной мембраной может образоваться очень просто. Многие молекулы с заряженными группами (например, жирные кислоты) в водной среде образуют микроскопические пузырьки — липосомы. Это слово должно быть хорошо известно прекрасной половине наших читателей: липосомы широко используются в косметических кремах — крохотные жировые капсулы начиняются витаминами и другими биологически активными веществами. А вот чем были наполнены древние «протоклетки»? Оказалось, что на роль «начинки» претендуют именно РНК.

Примеры веществ, способных образовывать мембраны
Структура липосомы
Уже древние примитивные клетки должны были обладать настоящей мембранной оболочкой. Её могли образовывать любые молекулы с заряженными группами, присоединёнными к неполярным структурам:
а) примеры веществ, способных образовывать мембраны;
б) структура липосомы — микроскопического пузырька, стенки которого состоят из двойного слоя молекул, обращённых заряженными группами в сторону водной фазы.

РНК умеет всё?

Жизнь, без сомнения, должна была начаться с образования «умелых» молекул, которые могли бы сами себя размножать и выполнять все другие «хозяйственные работы», необходимые для существования клетки. Однако на роль таких умельцев не подходит ни ДНК, ни белок. ДНК — отличный хранитель генетической информации, но сама себя размножать не умеет.

РНК тоже может формировать двуцепочечные спирали, подобно ДНК, но чаще всего молекулы РНК существуют в виде структур-клубков
РНК тоже может формировать двуцепочечные спирали, подобно ДНК, но чаще всего молекулы РНК существуют в виде структур-клубков. Именно такой является транспортная РНК человека, переносящая аминокислоту лизин. Структуру РНК можно показать в виде:
а) записи нуклеотидной последовательности;
б) схемы организации вторичной структуры (чёрточками соединены взаимодействующие комплементарные пары нуклеотидов);
в) трёхмерной пространственной структуры.
Белки — непревзойденные катализаторы, но не могут работать в качестве «генетических программ». Возникает парадокс курицы и яйца: ДНК не может образоваться без белка, а белок — без ДНК. И только РНК, как выяснилось, может ВСЁ. Но не будем забегать вперёд.

Рассмотрим давно известные функции РНК, связанные с работой (экспрессией) гена в клетке. При включении гена сначала происходит локальное расплетение ДНК и синтезируется РНК-копия генетической программы. В результате сложных обработок её специальными белками получается матричная РНК (мРНК), которая и является программой для синтеза белка. Эта РНК переносится из ядра в цитоплазму клетки, где она связывается со специальными клеточными структурами — рибосомами, настоящими молекулярными «машинами» для синтеза белка. Белок синтезируется из активированных аминокислот, присоединённых к особым транспортным РНК (тРНК), причём каждая из аминокислот присоединена к своей специфической тРНК. Благодаря РНК аминокислота фиксируется в каталитическом центре рибосомы, где она «пришивается» к синтезируемой белковой цепи. Из рассмотренной последовательности событий видно, что молекулы РНК играют ключевую роль в декодировании генетической информации и биосинтезе белка.

Чем больше углублялись в изучение различных биосинтетических процессов, тем чаще обнаруживали ранее неизвестные функции РНК. Оказалось, что кроме процесса транскрипции (синтеза РНК путём копирования участка ДНК), в ряде случаев, наоборот, может происходить синтез ДНК на РНК-матрицах. Этот процесс, названный обратной транскрипцией, используют в ходе своего развития многие вирусы, в том числе печально известные онкогенные вирусы и ВИЧ–1, вызывающий СПИД.

Таким образом, выяснилось, что поток генетической информации не является, как первоначально считалось, однонаправленным — от ДНК к РНК. Роль ДНК, как изначально главного носителя генетической информации, стала подвергаться сомнениям. Тем более что многие вирусы (гриппа, клещевого энцефалита и другие) вообще не используют ДНК в качестве генетического материала, их геном построен исключительно из РНК. А далее посыпались одно за другим открытия, которые заставили совершенно по-другому взглянуть на РНК.

Молекулы РНК выполняют ключевые функции в ходе биосинтеза белка.
Молекулы РНК выполняют ключевые функции в ходе биосинтеза белка. При «включении» гена происходит локальное расплетение спирали ДНК. Затем с гена, кодирующего белковую молекулу, синтезируется его РНК-копия. После ряда «превращений» она становится матричной РНК, т. е. матрицей для синтеза белка. мРНК переносится из ядра клетки в цитоплазму, где связывается с рибосомами, на которых и «производится» белок. Он синтезируется из активированных аминокислот, присоединённых к специальным транспортным РНК.

На все «молекулы» мастер

Наиболее удивительным было открытие каталитической способности РНК. Прежде считалось, что катализировать реакции умеют только белки, ферменты. Учёные, например, никак не могли выделить ферменты, осуществляющие разрезание и сшивание некоторых РНК. После длительных исследований выяснилось, что РНК прекрасно справляются с этим сами.

ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН
ЦКП «Секвенирование ДНК» СО РАН. Центр коллективного пользования дорогостоящим оборудованием для секвенирования ДНК был создан в 2000 году на базе Института Химической Биологии и Фундаментальной Медицины (ИХБФМ) и Института Цитологии и Генетики (ИЦиГ). ЦКП располагает полным комплексом современных автоматических приборов для анализа и расшифровки структуры генов и других участков ДНК.

Структуры РНК, действующие подобно ферментам, назвали рибозимами (по аналогии с энзимами, белками-катализаторами). Вскоре было обнаружено множество разнообразных рибозимов. Особенно широко их используют для манипулирования своими РНК вирусы и другие простые инфекционные агенты. Таким образом, РНК оказались мастерами на все руки: они могут выступать в роли носителей наследственной информации, могут служить катализаторами, служить транспортными средствами для аминокислот, образовывать высокоспецифичные комплексы с белками.

Окончательная уверенность в том, что «мир РНК» действительно существовал, наступила после выявления деталей строения кристаллов рибосом методом рентгеноструктурного анализа. Учёные рассчитывали обнаружить там белок, катализирующий сшивание аминокислот в белковую последовательность. Каково же было их удивление, когда выяснилось, что в каталитическом центре рибосом белковых структур нет совсем, что он полностью построен из РНК! Оказалось, что все ключевые стадии биосинтеза белка осуществляются молекулами РНК. Точка в дискуссии о возможности существования «мира РНК», как особой стадии биологической эволюции, была поставлена.

Конечно, полную картину ещё предстоит реконструировать — осталось много нерешённых вопросов. Например, в современной клетке активацию аминокислот и их присоединение к соответствующим тРНК осуществляют специфичные белки-ферменты. Возникает вопрос: могла ли эта реакция осуществляться без участия белков, только с помощью РНК? Могли ли сами РНК катализировать синтез РНК из нуклеотидов или присоединение азотистых оснований к сахару? В общем-то, после открытия рибозимов, такие потенциальные способности РНК уже не вызывали особых сомнений. Но наука требует, чтобы гипотезы экспериментально подтверждались.

Дарвиновская эволюция в пробирке

Хороший метод зачастую позволяет осуществить революцию в науке. Именно так можно сказать о методе полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет размножать нуклеиновые кислоты в неограниченных количествах. Кратко опишем суть метода. Для размножения ДНК в методе ПЦР используются ферменты ДНК-полимеразы, т. е. те самые ферменты, которые при размножении клеток синтезируют из активированных мономеров-нуклеотидов комплементарные цепочки ДНК.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет в неограниченном количестве «размножать» нуклеиновые кислоты, произвёл настоящую революцию в биологии. Суть метода проста: спираль ДНК разделяют нагреванием, а затем на каждой цепи с помощью специального фермента собирают цепочку, комплементарную исходной. В результате из одной двуцепочечной ДНК получается две. Из двух — четыре и т. д. Процесс можно повторять до бесконечности!
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет в неограниченном количестве «размножать» нуклеиновые кислоты, произвёл настоящую революцию в биологии. Суть метода проста: спираль ДНК разделяют нагреванием, а затем на каждой цепи с помощью специального фермента собирают цепочку, комплементарную исходной. В результате из одной двуцепочечной ДНК получается две. Из двух — четыре и т. д. Процесс можно повторять до бесконечности!

При методе ПЦР в пробирку с ДНК вносят смесь активированных нуклеотидов, фермент ДНК-полимеразу и так называемые праймеры — олигонуклеотиды, комплементарные концам размножаемой ДНК. При нагревании раствора цепи ДНК расходятся. Затем, при охлаждении, с ними связываются праймеры, образуя короткие фрагменты спиральных структур. Фермент присоединяет к праймерам нуклеотиды и собирает цепочку, комплементарную цепочке исходной ДНК. В результате реакции из одной двухцепочечной ДНК получается две. Если повторить процесс, получится четыре цепочки, а после n повторений — 2n молекул ДНК. Всё очень просто.

Изобретение ПЦР и разработка методов химического синтеза ДНК позволили создать потрясающую технологию молекулярной селекции. Принцип молекулярной селекции тоже прост: сначала синтезируется множество молекул, обладающих разными свойствами (так называемая молекулярная библиотека), а затем из этой смеси отбираются молекулы с желаемым свойством.

Библиотеки нуклеиновых кислот — это смеси молекул, имеющих одинаковую длину, но отличающиеся последовательностью нуклеотидов. Получить их можно в том случае, если при химическом синтезе на автоматическом синтезаторе добавлять на каждой стадии удлинения нуклеотидной последовательности одновременно все четыре нуклеотида. Каждый из них будет включаться в растущую нуклеиновую кислоту с равной вероятностью, в результате чего на каждом этапе присоединения будет получаться 4 варианта последовательностей. Если таким образом синтезировать нуклеиновую кислоту длиной в n звеньев, то разнообразие полученных молекул составит 4 в степени n. Поскольку обычно используются участки длиной 30–60 мономеров, то в результате синтеза получается от 430 до 460 разных молекул! Цифры, привычные разве для астрономов.

Так как в зависимости от состава нуклеиновые кислоты сворачиваются в разные пространственные структуры, синтез статистических последовательностей даёт огромное множество молекул, различающихся по свойствам. С образовавшихся ДНК — с помощью фермента РНК-полимеразы — считывается РНК. В результате получается библиотека уже одноцепочечных РНК. Далее производится процедура отбора: раствор РНК пропускается через колонку, в которой находится нерастворимый носитель с химически присоединёнными молекулами-мишенями, чтобы «выловить» так называемый будущий аптамер, т. е. вещество, способное связывать определённые молекулы. Затем колонку промывают для удаления несвязавшихся РНК, и удаляют РНК, задержавшиеся на колонке за счёт связывания с целевыми молекулами (это можно сделать, например, нагревая колонку).

Принцип молекулярной селекции очень прост: сначала синтезируют несколько миллиардов (!) молекул нуклеиновых кислот одной длины, но разного состава, а потом из смеси отбирают молекулы с нужными свойствами. Чтобы получить РНК, способные связываться с определённым веществом, его молекулы прикрепляют к специальным колонкам. Раствор с РНК пропускают через колонку, и несколько молекул из множества непременно свяжутся с молекулами-«мишенями». «Пойманные» РНК — аптамеры можно выделить и затем размножить с помощью ПЦР.
Принцип молекулярной селекции очень прост: сначала синтезируют несколько миллиардов (!) молекул нуклеиновых кислот одной длины, но разного состава, а потом из смеси отбирают молекулы с нужными свойствами. Чтобы получить РНК, способные связываться с определённым веществом, его молекулы прикрепляют к специальным колонкам. Раствор с РНК пропускают через колонку, и несколько молекул из множества непременно свяжутся с молекулами-«мишенями». «Пойманные» РНК — аптамеры можно выделить и затем размножить с помощью ПЦР.

С выделенных РНК делают ДНК-копии и получают из них обычные двуцепочеченые молекулы ДНК. С последних же можно считывать искомые РНК-аптамеры, а затем — размножать их методом ПЦР в неограниченных количествах. Конечно, так происходит в идеальном случае, на практике всё получается сложнее. Обычно исходный препарат РНК содержит огромный избыток «посторонних» молекул, избавиться от которого трудно. Поэтому полученную РНК вновь и вновь пропускают через колонку, чтобы выделить РНК, образующие самые прочные комплексы с целевыми молекулами. С помощью такого метода были получены тысячи разных РНК-аптамеров, которые образуют специфические комплексы с различными органическими соединениями и молекулами.

Аптамер, связывающий аминокислоту тирозин
Трёхмерная структура hammerhead рибозимаАптамер, связывающий аминокислоту изолейцин
Методом молекулярной селекции были выделены тысячи разных РНК-аптамеров, способных образовывать комплексы с самыми разными молекулами.
а) аптамер, связывающий аминокислоту изолейцин;
б) аптамер, связывающий аминокислоту тирозин;
в) трёхмерная структура hammerhead рибозима (Dunham C.M., Murray J.B., Scott W.G., 2003)

Рассмотренная схема молекулярной селекции может быть применена для получения молекул с любыми свойствами. Например, были получены РНК, способные катализировать реакции синтеза РНК и белков: присоединение азотистых оснований к рибозе, полимеризацию активированных нуклеотидов на цепочках РНК, присоединение аминокислот к РНК. Эти исследования ещё раз подтвердили, что в условиях предбиологической эволюции из случайных полимеров могли возникать молекулы РНК со специфическими структурами и функциями.

Делайте ваш заказ!

Метод молекулярной селекции обладает очень большими возможностями. С его помощью можно решать задачи поиска нужных молекул даже в том случае, если исходно нет идеи, как такие молекулы должны быть устроены. Однако если придумать процедуру отбора, их можно выделить по принципу требуемых свойств, а затем уже заняться и вопросом, как эти свойства достигаются. Продемонстрируем это на примере выделения РНК, способных связываться с клеточными мембранами и модулировать их проницаемость.

Автоматический секвенатор ДНК — прибор, с помощью которого «читают» гены
Автоматический секвенатор ДНК — прибор, с помощью которого «читают» гены.

Древние рибоциты должны были поглощать «питательные» вещества из окружающей среды, удалять продукты метаболизма и делиться в ходе размножения. И все эти процессы требуют управления проницаемостью мембран. Поскольку мы полагаем, что никаких других функциональных молекул, кроме РНК, в рибоцитах не было, какие-то РНК обязательно должны были взаимодействовать с мембранами. Однако с химической точки зрения они совершенно не подходят для роли регуляторов проницаемости мембран.

Мембраны современных клеток и липосом, построенные из жирных кислот, несут отрицательный заряд. Поскольку РНК также заряжены отрицательно, то, по закону Кулона, они должны отталкиваться от липидной поверхности и, тем более, не могут проникать вглубь липидного слоя. Единственный известный способ взаимодействия нуклеиновых кислот с поверхностью мембран — через двухзарядные ионы металлов. Эти положительно заряженные ионы могут играть роль мостиков, располагаясь между отрицательно заряженными группами на поверхности мембраны и фосфатными группами нуклеиновой кислоты. Поскольку такие мостиковые взаимодействия достаточно слабые, с мембраной может связаться только очень большая нуклеиновая кислота, благодаря множеству слабых связей с поверхностью мембраны. Так маленькие враги привязали Гулливера к земле множеством тоненьких верёвок.

Тут и помог исследователям метод молекулярной селекции. Из библиотеки РНКудалось выделить несколько молекул, которые очень успешно связывались с мембранами, а при достаточно высокой концентрации — даже разрывали их! Эти РНК обладали необычными свойствами. Они как бы помогали друг другу: смесь молекул разных сортов связывалась с мембранами гораздо лучше, чем молекулы одного сорта. Всё стало ясным после изучения вторичных структур этих РНК. Оказалось, что в них имеются петли с комплементарными участками. За счёт этих участков «мембранные» РНК могут формировать комплексы-сообщества, которые способны образовывать множественные контакты с мембраной и делать то, что одной молекуле РНК не под силу.

Схема формирования «мембранного» комплекса РНК на поверхности липосомы
Запись нуклеотидных последовательностей РНК, выделенных из препарата РНК, связывающегося с фосфолипидными мембранами
Отрицательно заряженные РНК могут взаимодействовать с отрицательно заряженными мембранами! Для этого они научились работать в «команде»:
а) запись нуклеотидных последовательностей РНК, выделенных из препарата РНК, связывающегося с фосфолипидными мембранами;
б) схема формирования «мембранного» комплекса РНК на поверхности липосомы.

Этот селекционный эксперимент подсказал, что у РНК есть дополнительный способ приобретения новых свойств путём образования сложных надмолекулярных комплексов. Этот механизм мог использоваться и для удерживания эволюционирующих систем РНК в виде колоний на поверхностях ещё до того, как эти системы обзавелись изолирующей мембраной.

«Мир РНК»: был, есть и будет!

Множество данных свидетельствует о том, что «мир РНК» действительно существовал. Правда, не совсем ясно — где. Некоторые специалисты полагают, что начальные этапы эволюции происходили не на Земле, что на Землю были занесены уже функционально активные системы, которые приспособились к местным условиям. Однако с химической и биологической точки зрения это не меняет сути дела. В любом случае остаётся загадкой — в результате каких процессов в окружающей среде рибоциты образовались и за счёт каких компонентов существовали. Ведь требуемые для жизни рибоцитов нуклеотиды — сложные молекулы. Трудно представить, что эти вещества могли образовываться в условиях пребиотического синтеза.

Вполне возможно, что древние РНК значительно отличались от современных. К сожалению, следов этих древних РНК экспериментально обнаружить нельзя, речь идёт о временах, удалённых от нас на миллиарды лет. Даже скалы тех времён давно «рассыпались в песок». Поэтому речь может идти только об экспериментальном моделировании процессов, которые могли протекать на самых ранних стадиях молекулярной эволюции.

Почему произошёл переход от «мира РНК» к современному миру? Белки, располагающие гораздо большим набором химических групп, чем РНК, являются лучшими катализаторами и структурными элементами. По-видимому, некоторые древние РНК стали использовать белковые молекулы в качестве «орудий труда». Такие РНК, способные к тому же синтезировать для своих целей полезные молекулы из окружающей среды, получали преимущества в размножении. Естественным путём отбирались соответствующие аптамеры и рибозимы. А затем эволюция сделала своё дело: возник аппарат трансляции, и постепенно ответственность за катализ перешла к белкам. Орудия оказались столь удобными, что вытеснили своих «хозяев» из многих сфер деятельности.

Читатель вправе спросить, — а зачем вообще нужно исследовать эволюцию РНК, ведь древний «Мир РНК» исчез? Неужели только ради «чистого искусства», удовлетворения интересов фанатичных исследователей? Однако, не зная прошлого, нельзя понять настоящее. Изучение эволюции и возможностей РНК может подсказать новые направления поиска процессов, протекающих в современных живых клетках. Например, совсем недавно были обнаружены мощные системы регуляции активности генов с помощью двуцепочечных РНК, с помощью которых клетка защищает себя от вирусных инфекций. Эта древняя система клеточной защиты, вероятно, скоро найдёт применение в терапии.

Поэтому неудивительно, что в наше время исследования нуклеиновых кислот продолжают оставаться одной из самых «горячих точек» в молекулярной биологии. Благодаря уникальным свойствам, РНК находят всё более широкое применение в медицине и технике. Возникший в незапамятные времена «Мир РНК» будет не только продолжать незримо существовать в наших клетках, но и возрождаться в виде новых биотехнологий.


Редакция благодарит сотрудников Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: к. х. н. В.В. Коваля, к. х. н. С.Д. Мызину и к. х. н. А.А. Бондаря за помощь в подготовке статьи.

Об авторах:

Власов Валентин Викторович
 — действительный член Российской Академии Наук, доктор химических наук, директор Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, заведующий кафедрой молекулярной биологии Новосибирского государственного университета, лауреат Государственной премии РФ.

Власов Александр Валентинович — кандидат химических наук, научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН.

«Наука из первых рук»

Комментарии: 0